Execução do Projeto | Antibióticos e Antifúngicos no Mel

Dia 1 (18/03/2023)

Méis comerciais utilizados para a procura de novos antibioticos e antifúngicos

Adquirimos 5 tipos de méis originários de diferentes regiões e produzidos por espécies de abelhas distintas:

Mel de jataí (Tetragonisca angustula) originado de flores silvestres;
Melato de abelha-europeia (Apis mellifera), originado de flores de bracatinga (Mimosa scabrella) nativas do Sul do Brasil;
Mel de abelha-européia, originado de flores silvestres na região de Campinas, São Paulo (SP);
Mel de abelha-européia, com favo, originado de flores silvestres na região de Atibaia, SP;
Sachê de mel de abelha-européia, originada de flores silvestres na região do estado de São Paulo.

Disolvemos cada tipo de mel na diluição de 1:3 e 1:1000 com água destilada estéril;
Preparamos 10 placas com o meio de cultivo YPD (Yeast Peptone Dextrose, composto por 10 g/l de extrato de levedura, 20 g/l de peptona, 20 g/l glucose) para crescimentos de fungos e leveduras;
Distribuímos as diluições sobre o meio de cultivo e deixamos na incubadora na temperatura 30 °C.

Dia 2 (25/03/2023)

YPD - 1:3
Mel de abelha-européia, originado de flores silvestres em Campinas

YPD - 1:3
Mel de abelha-européia, com favo, originado de flores silvestres em Atibaia

YPD - 1:3
Melato de abelha-europeia, originado de flores de bracatinga

YPD - 1:3
Mel de jataí, originado de flores silvestres

Fotografamos o crescimento dos fungos nas placas com a diluição de 1:3. Notamos que não houve a formação de colônias nas placas com a diluição de 1:1000, o que significa que não houve contaminação de micróbios estrangeiros. Concluímos que cada tipo de mel possui diferentes espécies de fungos;
Extraímos um fragmento de cada fungo crescido e imergimos em tubos de água destilada;
Pegamos uma alíquota dessa suspensão e observamos no microscópio óptico com lente objetiva de 63x.

Dia 3 (01/04/2023)

Preparamos estoques de diversos meios de cultivo sólidos (com ágar) e líquidos (sem ágar):

Para preparo de meio LB, pesamos 4 g de triptona, 4 g de NaCl, 2 g de extrato de levedura e 4 g de ágar e transferimos os reagentes secos para um frasco de 500 mL; adicionamos 400 mL de água destilada e esterilizamos por autoclavagem;
Para preparo de meio YPD, pesamos 4 g de extrato de levedura, 8 g de peptona e 4 g de ágar e transferimos os reagentes secos para um frasco de 500 mL; adicionamos 400 mL de água destilada e esterilizamos por autoclavagem. Após autoclavagem adicionamos 20 mL de estoque estéril de glucose a 40%;
Para preparo de meio HS, pesamos 2 g de peptona, 2 g de extrato de levedura, 1 g de fosfato disódio, 0,6 g de ácido cítrico, 8 g de glucose e 6 g de ágar e transferimos os reagentes secos para um frasco de 500 mL; adicionamos 400 mL de água destilada e esterilizamos por autoclavagem. Após autoclavagem adicionamos 20 mL de estoque estéril de glucose a 40%;
Para preparo de meio TMA, pesamos 4 g de peptona de caseína, 4 g de peptona de carne, 0,4 g de amido de milho, 1,6 g de dipotássio, 0,4 g de fosfato monopotássio 2 g de NaCl e 4,8 g de ágar e transferimos os reagentes secos para um frasco de 500 mL; adicionamos 400 mL de água destilada e esterilizamos por autoclavagem;
Para preparo de meio TSA, pesamos 2 g de digestão péptica de farelo de soja, 2 g/l de NaCl e 6 g/l de ágar e transferimos os reagentes secos para um frasco de 500 mL; adicionamos 400 mL de água destilada e esterilizamos por autoclavagem.

Dia 4 (08/04/2023)

Katherine Bilsland Marchesan e Luiza Rodrigues de Souza no LaBS (Labortório de Biologia Sintética)

Diluímos cada tipo de mel na diluição de 1:3 com água destilada;
Preparamos 10 placas com o cada meio de cultivo: LB, HS, TMA, TSA, para crescimento de fungos e bacterias;
Distribuímos as diluições sobre o meio de cultivo e deixamos na incubadora na temperatura 30 °C;
Utilizamos o kit Wizzard da empresa Promega para preparo de DNA genômico de fungos cultivados no dia 2. Seguimos os protocolos recomendados pelo fabricante.

Dia 5 (06/05/2023)

Fotografamos e documentamos o crescimento nos diferentes meios de cultura;
Repicamos 2 colônias de cada fenótipo para meios frescos e incubamos a 30 °C por 2 dias.

Dia 6 (13/05/2023)

Diluimos 1000x uma cultura saturada de Escherichia coli em meio LB líquido;
Transferimos 100 uL dessa suspensão para placas de Petri com meio TMA, espalhamos e deixamos secar;
Pipetamos 10 uL de culturas de bactérias e fungos sobre o filme e E. coli e deixamos secar antes de transferir para a incubadora por 2 dias.

Dia 7 (20/05/2023)

Fotografamos a formação de halos.

Dia 8 (27/05/2023)

PCR de bactérias antimicrobianas isoladas do mel

Realizamos reação em cadeia da polimerase (PCR) da região codificadora para o rRNA 18S;
Preparamos gel de agarose com brometo de etídio;
Carregamos as amostras de PCR no gel e fotografamos.

Dia 9 (03/06/2023)

PCR de fungos antimicrobianos isoladas do mel

Realizamos reação em cadeia da polimerase (PCR) da região codificadora para o rRNA 16S;
Preparamos gel de agarose com brometo de etídio;
Carregamos as amostras de PCR no gel e fotografamos.

Dia 10 (10/06/2023)

Purificação dos produtos de PCR das reações realizadas nos dias 8 e 9.

Dia 11 (02/09/2023)

Transferimos 1 mL de meio TMA líquido para poços individuais de placas de 48 poços;
Tiramos estoques de cada uma das linhagens prospectadas do freezer -80oC, mantendo em bloco refrigerado para evitar descongelamento, raspamos parte da suspensão congelada com ponteiras estéreis e transferimos para os poços correspondentes nas placas de 48 poços.

Dia 12 (09/09/2023)

Diluímos 100x uma cultura saturada de Saccharomyces cerevisiae em YNB sem uracila líquido;
Utilizamos hastes de algodão estéreis para transferir a cultura diluída para a superfície de meio YNB sem uracila com ágar, espalhamos e deixamos secar;
Transferimos 9 círculos pequenos de filtros de papel estéreis para posições determinadas das placas de petri e pipetamos 2 uL de culturas de bactérias e fungos sobre os discos de filtro. Deixamos secar antes de transferir para a incubadora por 2 dias.

Dia 13 (11/09/2023)

Fotografamos a formação de halos de inibição de fungos.

Dia 14 (30/03/2024)

Luiza Rodrigues de Souza e Katherine Bilsland Marchesan no LaBS (Labortório de Biologia Sintética) da Unicamp

Preparo de meios TSA (para crescimento de Bacillus), BDA (para crescimento de fungos filamentosos), BHI ágar (para crecimento de Streptomyces), utilizando as seguintes receitas (cada meio foi preparado em dobro):

TSA - 12g/400mL TSA + 8g/400mL ágar + 400mL água destilada;
BDA - 17,64g/400mL BDA + 400mL água destilada;
BHI - 14,8g/400mL BHI + 8g/400mL ágar + + 400mL água destilada.

Esterilização dos meios por autoclavagem e preparo de placas;
Plaqueamento e cultivo dos 70 microrganismos isolados em halos de inibição contra a bactéria X. citri, que causa doenças em plantas.

Dia 15 (06/04/2024)

Preparo de halos de inibição. Para cada um dos microrganismos cultivados foi testado a secreção antifúngica contra 2 fungos (Sclerotinia sclerotiorum, Rhizoctonia solanum) que atacam plantas de importância agrícola.

Dia 16 (13/04/2024)

As placas de halo de inibição preparadas anteriormente foram fotografadas;
Foi seguido o protocolo: Isolation of Genomic DNA from Gram Positive and Gram Negative Bacteria (Isolamento de DNA genômico de bactérias Gram positivas e Gram negativas);
O protocolo foi seguido corretamente em um tubo, e foi preparado um segundo tubo com alterações nas concentrações de agentes e enzimas conforme à validade dos produtos disponíveis em estoque:

Tubo 1 - 480µl EDTA, 120µl Enzimas líticas;
Tubo 2 - 240µl EDTA, 360µl Enzimas líticas.

Foi quantificado o DNA isolado dos dois tubos e foi observado uma concentração maior no segundo tubo. Descartamos o primeiro tubo e alteramos o protocolo conforme o segundo tubo;
No final, para o sequenciamento por nanoporo, o pellet de DNA foi rehidratado com 50µl de água ultrapura e incubado a 4ºC overnight.

Dia 17 (27/04/2024)

Foi seguido os protocolos: DNA Repair and End-preps (Reparo de DNA e preparações finais), Adapter Ligation and Clean-up (Liagção e limpeza do Adpater);
Foi testado a quantidade de poros ativos presentes nos flow cells, a biblioteca preparada foi carregada no flow cell e seguimos as instruções do programa de sequenciamento em tempo real, MinKNOW, para o sequenciamento;
Observamos que a quantidade de poros ativos está muito abaixo do esperado, pois o equipamento passou da validade em 2020.

Dia 18 (28/04/2024)

Foi feito o download das sequências recebidas. Apesar de estar trabalhando com materiais vencidos, conseguimos resultados com o sequenciamento.

Dia 19 (11/08/2024)

Quantificação do DNA genômico;
Seguimento do protocolo “DNA repair and end-prep”;
Carregamento do flow cell;
Iniciação do sequenciamento real-time (tempo real).